Proteomika

Úvod do proteomiky. Pojem proteom. Základní pojmy z oblasti separace a analýzy proteinů. Odvětví proteomiky. Význam expresní, diferenční a funkční proteomiky. Částečná separace proteinových směsí. Konvenční chromatografie, afinitní chromatografie, preparativní elektroforéza. Jednorozměrná (1D) elektroforéza - SDS/PAGE. Dvojrozměrná (2D) elektroforéza. Příprava vzorku. První dimenze - isoelektrická fokusace (IEF). Amfolyty, trubičkové IEF gely. Proužky s imobilizovaným pH gradientem ("IPG stripy"). Metodika a instrumentace IEF separace. Reversibilní barvení IPG stripů. Druhá dimenze - SDS/PAGE. Složení pufrů. Příprava gelů. Instrumentace SDS/PAGE (horizontální a vertikální aparatury). Barvení proteinů v SDS/PAGE gelech, kompatibilita barvení a hmotnostní spektrometrie. Fluorescenční barvení gelů. Analýza obrazu ("imaging"), denzitometrie, software pro vyhodnocení 2D gelů. Srovnávání dvou a více 2D gelů, diferenční analýza. Metoda DIGE. Vyřezávání (excize) proteinových spotů. Elektroeluce. Chemické a enzymové štěpení proteinů. Štěpení v gelu. Enzymový reaktor, štěpení na membráně. Obecné principy hmotnostní spektrometrie. Ionizační techniky využívané v proteomice. Ionizace elektrosprejem (ESI), laserová ionizace s účastí matrice (MALDI). Hmotnostní analyzátory, kvadrupól (Q), iontová past (IT), analyzátor doby letu (TOF), reflektron, iontová cyklotronová resonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS). Hybridní přístroje. Fingerprinting peptidových hmotností (peptide mass fingerprinting, PMF), de novo sekvencování peptidů. Sekvenční analýza metodou post source decay (PSD). Identifikace proteinů vyhledáváním v databázích. Vyhledávací programy pro PMF a MS/MS. Organismy s nesekvenovaným genomem, EST databáze, program MS Blast. LC-MS/MS peptidů. Shotgun proteomika - nástroj pro analýzu komplexních proteinových směsí. Multidimenzionální kapalinová chromatografie (LC) a kapilární elektroforéza (CE). Kombinace LC-LC, LC-CE, CE-CE. Technologie MuD-PIT. Posttranslační modifikace (PTM). Afinitní chromatografie fosfopeptidů. Hmotnostní spektrometrie fosfopeptidů a glykopeptidů. Kvantitativní analýza v proteomice: Metody H2O18, ICAT, SILAC, AQUA. Klinická proteomika. Biomarkery. Proteinové čipy. SELDI MS. Přečištění vzorku na afinitních materiálech. MALDI imaging. Charakterizace mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.