IZOLACE A PURIFIKACE REKOMBINANTNÍHO PROTEINU

Garant: RNDr. Petr Nádvorník, Ph.D.

Typ: B-Z-0/3/0 (výuka v blocích)

Typ ukončení: Zápočet, kolokvium

Kredity: 3

 

Sylabus cvičení:

Náplní tohoto praktického cvičení je transformace bakterií Escherichia coli plazmidem nesoucí gen pro enzym Taq-DNA-polymerázu, indukce bakterií pro jeho produkci, izolace a purifikace tohoto proteinu. Nakonec bude s tímto izolovaných a vyčištěným protinem provedena PCR amplifikace, aby se studenti přesvědčili, že získali plně funkční protein se zachovanou biologickou aktivitou, srovnali jeho koncentraci s komerčně dostupnou Taq-DNA-polymerázou a vyjádřili úsporu při laboratorní produkci tohoto enzymu.

Studenti si prakticky vyzkoušejí transformaci bakterií plazmidem, indukci exprese proteinu, izolaci proteinu a jednotlivé kroky jeho purifikace jednak vychytáváním cílového proteinu s His-tagem pomocí afinitní chromatografie na TALONové kuličky, a též alternativním postupem izolace za působení vyšší teploty a lyzozymu. Dále budou během jednotlivých kroků purifikace odebírat vzorky polymerázy v různém stupni čistoty. Na konci cvičení s těmito vzorky provedou orientační elektroforézu v polyakrylamidovém gelu, kdy po obarvení tohoto gelu budou moci sledovat ubývání nežádoucích příměsí mezi jednotlivými kroky purifikace.

 

Doporučená literatura:

Šmarda, J. a kol.: Metody molekulární biologie. Nakladatelství MU Brno, 2005. ISBN 80-210-3841-1.
Sambrook, J., Russell, D.W.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3rd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.
Rosypal S.: Úvod do molekulární biologie, I., II., III. a IV. díl. Brno, 1997.

 

Studijní materiály:
Izolace a purifikace rekombinantního proteinu.pdf